【基础科学、转化研究和临床试验】(综述）

                             血液代用品: 血红蛋白的氧载体（HBOCs）

      根据最近的报道，全球每年因出血导致的死亡率为190万人^[1]。这一惊人的统计数据相比早期报道中估计的每年500万人的死亡人数有所改善^[2]；然而与COVID-19相比，这种极高的死亡率依然持续存在，但是过去50年来在对提高急性贫血的生存率研究和成果相对缺乏。与开发新的疫苗等抗疫大流行工作相比，急性贫血的治疗相对简单。

1建立血液替代品需求的阶段

      本综述将描述出血问题的本质，以及在治疗出血和急性贫血方面已经进行了近50年的工作，除了输注红细胞外的其他治疗方法。随后将对基于血红蛋白的氧载体（HBOCs）进行简要历史介绍；在紧急情况下可能无法获得红细胞，并且患者拒绝输血以及血液不可选的情况下，HBOCs成为了一个选择^[3]。该领域的研究将被分为三个部分进行记录：基础科学;转化研究;临床试验。

1.1出血

       当事故受害者失血过多至濒临死亡时，当他们被救护人员救出并送往医院之前，救治他们的医疗手段非常有限，尽管新的措施已出现，如使用氨甲环酸作为止血药物^[4]，但较为单一的方法促使我们有必要开发一种新型血液替代品，这种替代品应具有多种医疗效果，旨在通过卫生保健专业人员的急救治疗来提高生存率。此血液替代品将包含液体、具有充氧能力（类似于红细胞）、止血能力和其他关键因素融入其中，以提高生存率 --这是改善目前失血性创伤医疗的一种革命性概念。

1.2输血医学和目前的护理标准

      输血治疗包括红细胞、血浆和血小板的输注是目前治疗出血最有效的疗法，但在大部分创伤发生的院外环境（受伤的偏远地点或战场），输血治疗常无法立即获得^[5]。当前院前治疗出血的标准方法是输入等渗晶体液（较少使用胶体，在民用和军事创伤中很少使用血液和血液制品）^[5]。然而，为了维持病人血压则需大量输注晶体，这可导致液体超负荷和红细胞被稀释（贫血），同时还会稀释血液中的凝血因子和其他有益介质。此外，晶体制品既不携带维持重要器官功能所必需的氧气，也不携带抑制进一步失血的凝血因子。

       最近Cochrane项目^[6]阐述了一个方案，其目标是评估创伤患者的出血严重程度与血制品输注在受伤后的D1开始的效果和安全性，此结果适用于各个年龄段的患者。显然，有必要了解和改进标准护理，包括血替代品和/或输氧剂。

       最新的出血和创伤复苏指南均承认在受伤初期提供携带氧气能力的重要性，以及后来需要解决止血问题才能提高存活^[7]。NICE通路已被构建用于院内出血，指南也提出快速输送携氧的需求对于生存至关重要，对后期凝血问题有重要影响。然而，没有血液替代品/氧气治疗，将氧气输送到缺血组织是困难的，除非通过体外膜肺氧合循环机器（ECMO），因为红细胞需要在毛细血管中释放氧气才能实现脉冲血流。可以推测，氧气治疗可在非脉冲情况下输送氧气，例如心肺复苏和胸部按压。最近的试验，如PAMPER试验，试图改善这一点，但仅限于当前已有的血液制品^[5]。因此，研发一种在管理出血，包括凝血功能障碍中既有效又无风险的“血液替代物”一直是一个长期的目标，但尚未实现^[3]。

1.3创伤失血性休克

       创伤失血性休克（THS）与手术出血相比，是一种高死亡、多种病理生理状况的表现，包括低血容量性贫血、凝血障碍、炎症和感染，是开放伤口和受损血管导致。目前，红细胞、血浆和血小板输注是治疗创伤性失血休克的最有效方法，但在发生大多数创伤性损伤的院外环境很少可得到血液。目前，THS的标准院前治疗是由急救保健专业人员进行的等渗晶体液输注。因此，一些以高渗溶液（3%~7%）制式的晶体液被提出是对出血患者更有效的复苏方法，因为它们可以实现“小容量”复苏，从而避免了传统等渗复苏引起的液体超负荷和继发性出血，后者通常需要2~3倍的液体量。小容量高渗溶液可具有抗炎作用；然而，最近的试验表明这些方法是无效的^[8]。虽然晶体液可以有效扩容，但其无法输送氧气置重要器官。此外，创伤患者常有凝血障碍，导致出血无法控制。对伊拉克战场上受伤的住院患者静脉注射重组人凝血因子VIIa的研究中发现其治疗有效 ^[9]。在伊拉克战争救治经验中发现早期使用VIIa减少了20%的输血量^[10]。

2 血红蛋白氧载体（HBOC）

       近期关于该主题的总结见为参考文献[3]。它回顾了迄今为止所有相关研究，并重点介绍了这一领域的11篇重要论文^[11-21]，并且它还向读者介绍了目前正在研究的最新产品。此外，该综述还揭示了当血液缺乏或无法使用时，无论是由于个人原因、不可用性还是不相容性是全球这些产品的需求。早在1934年，安柏森（Amberson）就纯化了牛血红蛋白并将其注入研究用的猫模型中，后于1949年总结了将纯化的人类血红蛋白注入分娩后失血的贫血产妇^[22]。美国军队继续开发，制造了四聚体交联血红蛋白（α-α交联血红蛋白），后来由拜耳公司生产了2,3-二乙酰水杨酸交联血红蛋白（HemAssist）^[23]，后因细胞灌注减少和发病率、死亡率增加，该产品在人体研究中失败了^[3]。在80年代中期制造商们开发了第二代HBOC，包括Biopure Corp.公司的HBOC-200，在1997年和1998年分别获得了FDA和欧盟的批准，用于治疗犬类贫血；Hemoglobin-glutamer-201（Hemopure，于2001年获得南非政府批准用于人类贫血治疗，并于2006年获得俄罗斯政府的批准）^[24]。多项研究对这些产品进行了动物研究和人体试验的严格评估，记录了在I、II和III试验阶段取得的成功结果^[25-26]。

2.1异基因输血的风险

       输注血液是最常见的医院治疗之一，自1795年以来一直在实施。尽管普遍但与输血相关的风险最常见的包括：铁过载、输血相关急性肺损伤^[1]以及相关死亡的比例较高^[27]。得益于不断发展的输血检测技术，部分风险已经可避免包括传染性疾病(HIV、丙型肝炎、疟疾等)、相容性问题和输血相关急性肺损伤^[28]。血液制品易于获取以及相关风险的要求，推动了对既安全又有效的氧载体的需求。适用的替代血液将消除交叉配型的需求，降低病原体传播的风险，增加在偏远地区的可用性，并能够储存更长的时间。目前已进行了大量的研究来构建替代血液。最早的方法涉及去除红细胞(RBC)膜并输入无保存液的血红蛋白(SFH)。然而，输入SFH会造成极端溶血，导致黄疸、肾功能衰竭和死亡^[11]。为增加稳定性并避免溶血，血红蛋白氧载体(HBOC)使用纯化的人类、动物或重组血红蛋白(Hb)作为无细胞制备^[11]。早期的HBOC存在不良事件，包括肾功能衰竭、清除一氧化氮(NO)导致血管收缩以及氧化导致高铁血红蛋白血症^[29]，这些不良反应是由于血红蛋白四聚体被裂解成二聚体所致。为解除不良反应，特别是降低血管收缩严重程度，已经应用了几种修饰方法，例如交联、聚合和与聚乙二醇(PEGylation)的包覆，这些都将在后续讨论中进行^[30]。

2.2第二代血红蛋白氧载体(HBOC)及其发展趋势的进展

        无细胞血红蛋白通常通过超滤或结晶法制备。超滤法在离体灌注心脏试验中，得到不产生血管收缩和收缩抑制作用的无细胞血红蛋白（SFH）^[31]。尽管上述不良效应阻止了无细胞血红蛋白的使用，但研究结果有助于表明超滤法应该是首选的生产方法。在改进无细胞血红蛋白的基础上，我们假设交联可能有助于减少不良反应。这个假设通过交联血红蛋白 (diaspirin-crosslinked Hb，DCLHb)，即HemAssist进行评估。由于死亡率增加，患者出现了严重的血管收缩不良事件，因此SFH后面的研究被中止^[23]。

在HemAssist评估失败后，第二代HBOC应运而生。第一个称作Hemolink^[24]。Hemolink是从过时的人类红细胞制备的交联HBOC^[24]。接下来的Polyheme，是由过时的红细胞中戊二醛聚合的人体血红蛋白，主要用作复苏液^[25]。该产品在III期试验中因死亡率失衡的负面结果而中止^[32]。目前尚未知于此结果是由于产品本身还是由于试验方案设计引起的。在创伤试验中，还引发了一些与缺乏受试者同意和社区同意的伦理问题^[33]。第二代HBOC的最后一个产品是Hemopure（HBOC-201），它是由纯化的牛血红蛋白交联并用戊二醛聚合而成。Hemopure不含任何细胞膜抗原，因此可能被所有血型耐受^[16]，其优势在于在贫血或低血流情况下保持对缺血组织的氧供应。

      在第二代HBOC遭遇挫折后，研究人员开始专注于开发一种避免交联/聚合HBOC所示的毒性化学和生物物理效应的产品。研究人员开始研发一种用于无法进行输血或由于健康或宗教原因无法进行输血情况下的产品，而不是用于替代输血。深入研究表明，氧结合剂在预防或治疗缺血相关的疾病时可使死亡率降低^[34]。这种新思路的转变形成的第一个产品是Hemospan/MP4（San Diego的Sangart公司）。通过修饰人类血液中的血红蛋白与马来酰亚胺-聚乙二醇发生反应，这是一种血浆扩容剂，具有扩血管作用，与既往使其血管收缩形成鲜明对比。

       MP4在I期研究中表现出极大潜力，当作用于健康患者时，与其他含氧血红蛋白制剂不同，它不会引起高血压或产生任何胃肠道副作用^[35]。然而，在进一步的II期试验中，MP4的使用会导致血管收缩，这是由于未交联的游离血红蛋白释放引起的，因此无法成功缓解先前血红蛋白制剂引起的问题。

2.3人体研究中较新产品的最新进展

       目前新概念产品的发展改变了前几代HBOC降低血红蛋白 (从10～13 g/dL到4～6 g/dL)和血红蛋白氧解离使曲线从右向左移动的特征（p50从30～40mmHg降至6mmHg）（OxyVita和MP4）^[3,17]。然而，这些改进还需经过独立验证。最新一代HBOC正在进行人体试验评估，Saguinate是最新一代HBOC具有类似的药理特性，相关研究成果已被发表^[3]。来自Hemarina（法国布列塔尼地区）的一种海洋蠕虫源HBOC也已经在少数人体试验中进行了评估，并用于与COVID-19相关的肺衰竭^[3,36]。

2.4临床试验

      多个关于HBOCs的临床试验已进行，以评估其在各种疾病状态下的安全性和有效性。研究最多的领域是作为氧载体促进输送到低氧和缺血组织，希望机体内平衡恢复并保护生存。以下列举了一项临床试验，此项实验可为血液替代品获得批准提供证据，其中一项关键试验比较了仅剩的可供人体使用的HBOC与红细胞。虽然没有任何产品或试验是完美的，但是这些研究都致力于解决一直未能解决的问题，并且希望在更多国家获得监管批准后，让更多生命在出血和手术出血时因无法使用或获得血液得到拯救。

       临床试验HEM-0115目前处于阶段III，运用前瞻性、随机、单盲试验，选择688名计划进行骨科择期手术的受试者，根据第一次输血进行随机分组，接受Hemopure（250mL中的1.3g/L血红蛋白）或红细胞治疗与手术相关的贫血^[14]。Hemopure的p50为40 mmHg，而成年红细胞的p50为27mmHg，因此氧合血红蛋白曲线向右移动，以便更容易将氧气装卸到组织中。

输血阈值包括[THb]＜1.05g/L，并且患者至少出现以下一种临床征象：心率100次/min以上；收缩压低于90mmHg或低于术前筛查值的70%；心电图显示心肌缺血；代谢性酸中毒（碱失衡≤-4或更差）；2h内或更短时间内的急性出血＞体重的7mL/kg；持续2h或更长时间的尿量少于0.5 mL/kg /h。这个阈值在当今的护理标准下被认为是高的，但是在试验进行时是标准的^[3]。此外，输血阈值包括2h内或更短时间内血红蛋白7 mL/kg以下作为纳入标准^[14]。

将350名患者随机分配给Hemopure输注组，338名患者随机分配给红细胞组。根据收集的临床试验资料提示，大多数Hemopure受试者接受了5个或更少的250mL输注，约18.7%的受试者接受了6～10个250mL的输注；一个患者接受了330克或11次输注。相比之下，红细胞组受试者平均接受了243±9克血红蛋白，其中78.4%接受了≥2单位的输注^[14]。

       一旦使用Hemopure开始治疗，会先进行2个单位（500mL）的Hemopure负荷剂量，并允许在最多6d内以10个单位Hemopure（130g血红蛋白）的最大剂量进行额外治疗，使用与入组相同的标准。在使用10个单位Hemopure后仍需持续输送氧气的情况下，将Hemopure随机受试者转为接受红细胞输注。避免输血是主要的结果措施，并进行了盲法、安全性评估。这个III期研究的设计要求限制对Hemopure的输注量。在严重出血情况下，达到限制Hemopure输注后，患者会转为接受红细胞输注。临床试验情景模拟了使用Hemopure直到红细胞的数量可用于替代选择性手术的中度(≤3单位红细胞)失血量^[14]。

3总结

      本综述描述失血性休克的重要发病率和死亡率，急性失血休克时常得不到充分的治疗，或由于血液不可用或不可选用而无法在失血后及时治疗，在围术期输血管理中，预期失血量通过输注红细胞和凝血因子来管理，但由于同种异体输血存在内在风险，可能会恶化治疗效果。基于血红蛋白的氧载体(HBOC)可能是急性贫血的解决方案，无论其病因如何，都可以迅速提供组织氧合，即使无脉冲血流的情况下也可进行。这样做可能会降低失血死亡率，该死亡率每年可占190~500万人，即使与COVID-19大流行造成的毁灭性死亡相比也相形见绌。因此，继续研究血红蛋白的氧载体(HBOC) 是必要的，尽管在试验和产品方面存在多次挫折，但进一步的研究和资金支持非常有意义，特别是对于那些最有前景的产品来说，提出了是否创建具有高或低p50值的血红蛋白的氧载体的问题，虽然Hemopure已经将氧合血红蛋白曲线向右移动，但已经开发出一些新产品具有较低的p50值，类似于胎儿血红蛋白（p50 = 19 mm Hg），甚至更低，其概念只用于有严重低氧血红蛋白才会装卸氧气，仅提供给严重衰竭的组织；然而，尚未进行比较研究来证明哪种更有效^[37]。Hemopure可能是其中一种基于血红蛋白的氧载体，因为自2001年在南非获得人类使用批准以来，已进行了多项人体试验，并持续使用，证明了其安全和疗效性。更为重要的是，要找到那些在维持安全性的同时提高生存率的方法。尽管所有药物治疗都会出现不良事件，接受这些不良事件并调整使用和适应症，使得益处超过风险，这是所有生命的挑战。

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文章来源： Jonathan S. Jahr, Blood substitutes: Basic science, translational studies and clinical trials, Front Med Technol, 2022 (4) ：989829.

供稿人： 年青

2023-10