【综合信息】

1.iPLAT1：iPSC来源血小板作为I期自体输血研究的首次人体临床试验

   同种异体免疫性血小板输注无效（Alloimmune platelet transfusion refractoriness, allo-PTR）是一种临床难题，约5%~15%的血小板输注患者对I类人白细胞抗原（class I human leukocyte antigens, HLA-I）)和人血小板抗原 （human platelet antigens, HPA）等同种异体抗原致敏。为了给没有匹配的注册捐献者的allo-PTR患者提供可输注的血小板，我们开发了一种诱导多能干细胞来源的血小板产品（induced pluripotent stem cell-derived platelet, iPSC-PLT）。我们之前通过强力环素诱导c-MYC、BMI1和BCL-XL在iPSCs分化过程中的过表达建立了永生化巨核细胞祖细胞系（immortalized megakaryocyte progenitor cell lines, imMKCLs）。     imMKCLs通过3种转基因的表达进行扩增，随后成熟并生成iPSC-PLT。我们通过研发湍流介导的VerMES生物反应器促进血小板生成，联合使用血小板生成素模拟物TA-316、Rho相关激酶（Rho-associated kinase, ROCK）抑制剂Y-39983和芳基烃受体（arylhydrocarbon receptor, AhR）拮抗剂GNF-316减少血小板粘附，使用ADAM17抑制剂KP-457阻断GPIbα（CD42b）的脱落，进一步在体外生产了临床所需1011级别的iPSC-PLTs。

   iPSC-PLTs根据药品生产质量管理规范（good manufacturing practice, GMP）生产，使用17个新建立的患者特异性imMKCLs作为主细胞库（master cell bank, MCB）,并经γ射线辐照(25 Gy)消除iPSC-PLTs、imMKCLs的致瘤潜能。与日本红十字会(Japanese Red Cross Society, JRC-PLTs)提供的供体血小板相比，iPSC-PLTs更大但超微结构与前者相似，同时其质量和功能可至少维持5d。与在兔模型中使用JRC-PLTs和iPSC-PLTs输注的结果一致，iPSC-PLTs输注患者体内后2~7h内显示出体内循环稳定,止血成功率为100%。随后IVIS成像测试证实了iPSC-PLTs在体循环和肺、肝和脾中的分布，类似于普通血小板输注后的分布模式。相比之下，imMKCLs输注后分布大多局限于肺部。关于确认iPSC-PLTs质量和安全性的生产和非临床试验的更多细节发表在《血液进展》杂志上。

   来自患者的iPSC-PLTs自体输血临床试验(iPLAT1研究)由京都大学和厚生劳动省批准，在日本临床试验注册中心注册号为jRCTa050190117。入选患者是一名55岁的日本女性，有两次妊娠史，在47岁时被诊断患有重症再生障碍性贫血。在抗胸腺细胞球蛋白给药预处理后进行了第一次血小板输注，随后出现了39.8℃的发热和全身性肿胀皮疹，伴血小板计数未增加，诊断为抗HPA-1a抗体引起的allo-PTR。然而，日本患者的HPA-1b/1b表型频率估计低于0.002%，并且JRC资料库中未登记该型献血者。幸运的是，环孢素单一疗法对其有效，并最终在54岁时完成相应治疗。在51岁时，患者因乳腺癌进行了乳房切除术和淋巴结清扫。术后化疗为单一疗法，并降低了药物剂量以避免严重的血细胞减少。

   iPSC-PLTs的生产符合规范并进行了超微结构、添加剂残留浓度和无菌性的质量控制，以1×10¹⁰、3×10¹⁰和1×10¹¹三个递增剂量依次给药(分别为日本标准输血剂量的1/20、3/20和1/2)。至于主要终点不良事件的频率和程度，患者在整个研究期间没有出现任何显著的临床症状或体征。实验室数据显示无明显变化，但第2和第3组输血后24～11h，一种凝血标记物、D-二聚体和白细胞（white blood cell, WBC）计数水平略有增加。然而，下肢超声检查没有发现深静脉血栓形成，D-二聚体浓度随后自然降低。至于校正的计数增量（corrected 14   count increment, CCI）的次要终点，即使在队列3中，1h和24h的CCI均为0。然而，外周血的流式细胞仪分析显示输血后存在较大的血小板，并逐渐减少。外部疗效和安全性评估委员会(external Efficacy and Safety Assessment Committee, ESAC)确认了iPSC-PLTs输注的安全性，批准了第1组和第2组在28d随访后过渡到下一组，并在第3组1年的观察期后得出结论，iPSC-PLTs自体输血对该患者是安全的。

  鉴于抗-HPA-1a可导致输血后紫癜，甚至降低输注后血小板计数，该研究结果具有重要意义。CCI为0可归因于与输注前的高血小板计数相比难以检测到相对较小的增加以及使用的普通血细胞计数设备可能会忽略大尺寸的iPSC-PLTs。然而，我们通过流式细胞术在输注后样本中观察到较大的血小板群，提示了它们的循环。此外，根据兔子研究中的动力学，CCI可能在2～6h后达到峰值，因此本研究错过了最佳检测时间点。延迟的峰化可能是由于大尺寸iPSC-PLTs的片段化，正如在以前使用小鼠模型的研究中所示。

   同时，输血后D-二聚体的轻微增加可能表明输注后不久iPSC-PLTs发生凝血。同时出现的白细胞轻微增加进一步表明炎症加重。虽然输注的免疫球蛋白数量很少(＜107)，但这种反应可能是由巨核细胞的免疫特性引起的。然而，据报道，只有肺实质中的巨核细胞具有免疫表型，本研究中输注的imMKCLs可能滞留在了肺循环中。此外，受损的循环可能是由于辐照引起的轻度激活或糖基化和唾液酸化的异常状态，这反映了iPSC-PLTs的可能的胚胎/胎儿性质，如在红细胞中所见。我们计划在未来的研究中彻底评估这些可能性。

   总之，我们成功地为一名没有相容血小板供体的患者进行了基于GMP的1011细胞级别自体iPSC-PLTs的临床规模生产，并完成了iPSC-PLTs的首次人体临床试验，通过剂量递增研究确保了产品的安全性。同时，研究揭示了动物模型和人类受试者之间的循环差异。

   在生产iPSC-PLTs的效率和成本方面的显著改进可以实现自体血小板产品的实用性及个体化。此外，本研究中的生产系统和观察到的结果应有助于临床应用同种异体iPSC-PLTs的即供即用。鉴于同种异体PTR的主要致病抗原是HLA-I类抗原，遗传上去除HLA-I类抗原的iPSC-PLTs可作为大规模生产的最佳产品，HPA的额外遗传转化是一种选择。这项研究将使许多血小板减少症患者，特别是同种异体PTR患者，受益于这种输血医学和再生医学的组合形式。

关键词：iPLAT1；iPSCs；血小板；imMKCLs

原文献：Sugimoto N, Kanda J, Nakamura S, et al. iPLAT1: The first-in-human clinical trial of iPSC-derived platelets as a phase 1 autologous transfusion study[J]. Blood. 2022.

黄韦华 钱宝华 投稿

2022年10月10日